Батаева Д.С., канд. техн. наук, Зайко Е.В,
Юшина Ю.К., канд. техн. наук, Горбунов В.Н
ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова
ООО «Биотест-Пущино»
Реферат
Чрезмерное применение антибиотиков при выращивании сельскохозяйственных животных имеет серьёзные риски для здоровья человека, а также отражается на качестве и безопасности мясной продукции, изготовленной с использованием стартовых культур. Для эффективного контроля содержания антибиотиков в мясе необходимы мультискрининговые методы, которые позволят определить одновременно большинство используемых групп антимикробных химиотерапевтических препаратов. Одним из них является микробиологический метод, представленный в ГОСТ Р 55481–2013. Целью нашей работы являлась оценка возможности применения метода для выявления расширенного перечня антибиотиков в концентрациях максимально допустимого уровня, установленных в Техническом регламенте Таможенного союза (ТР ТС) 034. На основании полученных нами результатов, установлена эффективность метода ООО «Биотест-Пущино» для выявления 35 антибиотиков из 14 групп, 22 из которых выявляются на максимально допустимых уровнях, установленных для мяса. Метод не требует высокой квалификации персонала, крупных материальных затрат и может быть реализован в любой производственной лаборатории
Введение
Максимальные допустимые уровни остатков лекарственных средств, в том числе антибиотиков в продуктах убоя животных отражены в Техническом регламенте Таможенного союза 034/2013. В другом Техническом регламенте Таможенного союза 021/2011 к непереработанному продовольственному (пищевому) сырью животного происхождения предъявляется требование к способу получения сырья, оно должно быть получено от продуктивных животных, которые не подвергались воздействию антибиотиков и других лекарственных средств ветеринарного назначения, а если под-
вергались, то после истечения срока их выведения из организмов животных .
При несоблюдении этого требования оно может содержать остаточные количества антимикробных препаратов .
Использование лекарственных средств в ветеринарии — неотъемлемая часть интенсивного животноводства.
Первоначально ветеринарные антибиотики использовались только для лечения болезней животных, но постепенно
их начали использовать в качестве добавок к кормам для профилактики распространения различных заболеваний .
Кроме того, для стимуляции роста интенсивно применяются кормовые антибиотики. Согласно данным Росстата,каждый год увеличивается производство кормовых антибиотиков, так, более
ста тонн продукции было произведено в 2017 году, и ежегодно этот показатель только увеличивается.
Чрезмерное применение антибиотиков у сельскохозяйственных животных имеет серьёзные риски для здоровья человека, так как способствует появлению устойчивых к антибиотикам бактерий
и, как следствие, генов резистентности, которые могут быть переданы людям .
Особую опасность представляетиспользование мяса с антибиотико-резистентными штаммами бактерий при производстве мясных продуктов, не предполагающих высокотемпературную обработку, например, таким, как сырокопчёные мясные изделия, т.к. некоторые
устойчивые бактерии горизонтальным переносом передают другим — неустойчивым генам антибиотикорезистентности .
Для предотвращения контаминации мясной продукции антибиотиками контроль должен осуществляться на всех технологических этапах от получения мясного сырья (входной контроль каждой партии) до готовой продукции. Контроль за антимикробными лекарственными веществами в мясе и продуктах убоя проводится в соответствии с информацией об их использовании, предоставляемой изготовителем или поставщиком, при ввозе на территорию Таможенного союза или при поставке продуктов убоя на переработку. При этом, согласно ТР ТС 021, в обязательном порядке исследуют мясо
и субпродукты только на наличие левомицетина (хлорамфеникола), антибиотиков тетрациклиновой группы и бацитрацина. Согласно Приложению 5 ТР ТС 034, максимально допустимые уровни определены для 51 антибиотика.
Более того, с 14 августа 2018 года вступило в силу Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 13.02.2018 № 28, содержащее Перечень ветеринарных лекарственных средств и фармакологически активных веществ, максимально допустимые уровни (МДУ) остатков которых, могут содержаться в не переработанной пищевой продук-
ции животного происхождения, в том числе в сырьё. 72 ветеринарных препарата, наиболее часто используемых на
территории стран Таможенного союза, включены в данный список с рекомендуемыми методиками исследований их остаточных количеств.
Контроль за антимикробными лекарственными средствами не обязывает переработчика осуществлять производственный контроль на наличие всех вышеперечисленных ветеринарных лекарственных средств. Получая информацию от поставщика сырья животного проис
хождения о применявшихся антибиотиках, переработчик может проверить поступающее сырьё на наличие остатков именно этих антибиотиков.
Ответственность за соблюдение соответствующих требований по применению антибиотиков в сельском хозяйстве полностью возлагается на производителя мяса. Понятно, что такая система кон-
троля нуждается в усовершенствовании и изменении как самого порядка исследований, так и методов контроля.
Анализ методов контроля антимикробных химиотерапевтических ве
ществ в различных пищевых системах демонстрирует мононаправленность их применения . Применение физико-химических методов в силу дороговизны анализа, которая складывается из стоимости оборудования, расходных материалов, а также необходимости наличия высококвалифицированного
специалиста, возможно в ограниченном количестве лабораторий, в числе которых редко встречаются производственные. Поэтому эти методы трудно реализуются в условиях производственных лабораторий мясоперерабатывающих предприятий. Для производственного контроля более эффективными являются методы, позволяющие провести скрининговые определения наличия антибиотиков, т.е. уникальный мультискрининговый метод контроля, который даёт возможность определить в образце одновременно все используемые группы антимикробных химиотерапевтических препаратов.
Один из них представлен в ГОСТ Р 55481–2013, область применения которого распространяется только на мясо и субпродукты, в т.ч. птицы. Качественный метод определения остаточных количеств антибиотиков, отражённый в этом документе, позволяет
через 6 часов получить результаты без использования специального дорогостоящего оборудования. Предложенный метод не требует высокой квалификации персонала и может быть реализован
в любой производственной лаборатории. При этом стоимость расходных материалов на один анализ невелика.
Целью данной работы является оценка разработанного нами в 2013 году ГОСТ Р 55481 и успешно используемого в лабораторной практике, метода на возможность расширения перечня выявляемых антибиотиков, согласно Приложению 5 ТР ТС 034.
Материалы и методы
В работе использовали:
¤¤стандартные образцы антибиотиков (Sigma, Германия). Приготовление стоковых растворов проводили согласно
инструкции производителя. Из стоковых растворов готовили рабочие растворы, соответствующие по концентрации максимально допустимому уровню антибиотиков в мясе, согласно ТР ТС 034 (таблица 1),
а также растворы, концентрации которых превышают МДУ. При приготовлении стоковых и рабочих концентраций антибиотиков использовали разбавители: воду, 1 M раствор NaOH и N, диметилформамид (DMF).
¤¤тест-набор (Биотест–Пущино, Россия),
в состав которого входит плотная питательная среда с индикатором бромкрезоловый пурпурный и суспензией спор Geobacillus stearothermophilus, во флаконах по 10 мл, а также пробочное сверло.
Содержимое флакона растапливают на водяной бане, затем охлаждают в условиях комнатной температуры, сразу разливают в чашки Петри и дают агару затвердеть. С помощью пробочного сверла в затвердевшей среде вырезают лунки. Допускается на одной чашке Петри вырезать от 2-х до 7-и лунок. С наружной части чашки Петри контур лунки обводят тонким маркером. Раствор антибиотика
вносят параллельно в 2 лунки с помощью дозатора переменного объема по 0,05 см3. Затем чашки Петри с исследуемым материалом выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин для диффузии надосадочной жидкости в агар. Инкубируют чашки в термостате (Binder, Германия) при температуре (65 ± 1) °C не менее 4 ч крышками вверх до изменения цвета среды с синего на жёлтый.
Ингибирование роста тест-культуры в зоне шириной ≥ 2,0 мм, оценивали как положительный результат, т.е. как нали чие антибиотиков или других антимикробных химиотерапевтических веществ в анализируемой пробе.
Наличие роста тест-культуры с изменением цвета питательной среды с синего на жёлтый или отсутствие роста тест-куль-
туры в зоне шириной менее 2,0 мм оценивали как отрицательный результат, т.е. как отсутствие антибиотиков или других
антимикробных химиотерапевтических веществ в анализируемой пробе.
Результаты исследования
Было исследовано 35 различных антибиотиков, внесённых в Приложение 5 ТР ТС 034 и вошедших в Решение № 28 Коллегии Евразийской экономической комиссии от 13.02.2018.
На рисунках 1, 2, 3, 4, 5 отражены результаты исследования.
Из протестированных антибиотиков 22 проявили ингибирующую способность по отношению к тест-микроорганизму Geobacillus stearothermophilus в концентрациях максимально допустимого
уровня, установленного для мяса. Они представлены цефалоспоринами, антибиотиками тетрациклиновой группой, пенициллиновой группой, а также аминогликозидами,
нитрофуранами и линкозамидами (рисунки 1, 2).
Те антибиотики, которые не проявили ингибирующую способность в концентрациях максимально допустимого уровня, были исследованы в концентрациях, превышающих МДУ. Результаты представлены на рисунках 3, 4, 5.
Результаты исследований по 8 антибиотикам,
представленным на рисунках 3, 4, 5, демонстрируют, что чувствительность данного метода исследования находится выше МДУ, указанного в ТР ТС 034. Это не ограничивает возможности метода по их выявлению, что и было доказано при исследовании более высоких концентраций антибиотиков на этих 6-и группах
антибиотиков.
Для антибиотиков: тиамулина, колистина, спирамицина и флорфеникола при получении отрицательных результатов для концентраций, указанных в таблице 1, проводились исследования
других, более высоких концентраций, установленных на уровне 10,0; 15,0 и 20,0 мг/кг соответственно. Данные уровни антибиотиков проявили антибактериальный эффект в агаре на тест-микроорганизмах.
Таким образом, предлагаемым нами методом можно выявить в мясе
и в субпродуктах убойных животных, в т.ч. птицы, 14 групп антибиотиков одновременно. При этом не требуется специального оборудования, а также высококвалифицированного персонала для
его применения. При этом максимальная продолжительность исследования может занимать не более 6 час.
Все эти преимущества позволяют внедрить метод в широкую лабораторную практику для испытания большого количества образцов мяса. Установив факт наличия антибиотиков в мясе, можно
проводить последующую идентификацию и количественное определение антибиотиков с помощью специальных хроматографических методов. В мире практикуется использование микробиологических тестов, основанных на таком же принципе действия, как и использованный нами метод. Подобные методы
показали свою эффективность при качественном определении антибиотиков в мясе и молоке.
Авторы планируют доработать микробиологический метод для возможности классифицировать антибиотики на группы перед последующим хроматографическим анализом. Разработаны
микробиологические тесты, например,для молока, позволяющие определять группы выявленных антибиотиков, в частности беталактамов, хинолонов, сульфамидов и тетрациклинов. Но это
требует использование нескольких микроорганизмов (G. stearothermophilus, B. cereus, B. subtilis), питательных сред
и индикаторов. Чувствительность метода, например, для амоксициллина при использовании G. stearothermophilusс
с 2-я разными питательными средами составляет 0,007 и 0,014 мг/л соответственно. Максимально допустимый уровень этого антибиотика в молоке составляет 0,004 мг/л, что ниже чувствительности метода [10]. Сравнение МДУ амоксициллина для мяса (0,05 мг/кг) и молока (0,004 мг/л) позволяет указать на существенно различающуюся чувствительность данного метода для разных видов продуктов. При дальнейшем усовершенствовании метода, перспективным направлением представляется увеличение его чувствительности до МДУ для некоторых антибиотиков.
Выводы
Возможности качественного микробиологического метода согласно
ГОСТ Р 55481–2013 были обоснованы полученными результатами исследования 35 антибиотиков из 14 групп. Результаты были получены в течение 6 часов без использования специального дорогостоящего оборудования. Предложенный метод не требует высокой квалификации персонала и может быть реализован
в любой производственной лаборатории. При этом стоимость расходных материалов на один анализ невелика.
Необходимость мультискрининговых методов очевидна и отражена в требованиях ТР ТС.
Источник: журнал ВСЕ О МЯСЕ № 3 | 2019 стр 14
